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邢新會團隊丨高通量自動化微生物微液滴進化培養與篩選技術及其裝備化

作者:admin 發布時間:2021/04/07 瀏覽量:2938

過程控制及設備

郭肖杰1,2,王立言3,張1,2,4,邢新會1,2,4,5

清華大學 化學工程學系
工業生物催化教育部重點實驗室
清華大學 無錫應用技術研究院
清華大學 合成與系統生物學中心
清華大學 深圳國際研究生院生物醫藥與健康工程研究院

摘要:液滴微流控由于可以快速生成大量微液滴,并實現單個液滴獨立的控制,每個液滴都可以作為獨立的單元進行微生物培養,因此在微生物的高通量培養方面具有獨特的應用優勢。然而現有研究多停留在實驗室搭建和使用階段,存在操作要求高、影響因素多、缺乏自動化集成技術等關鍵問題,制約了液滴微流控技術在微生物研究中的應用。文中以解決液滴微流控技術用于微生物培養的裝備化問題為目標,系統研究了微流控各單元模塊的結構與功能,通過對液滴的發生、培養、檢測、分割、融合、分選等多種操作的開發與集成,成功研制出了小型一體化、全自動高通量的微生物微液滴培養 (Microbial Microdroplet Culture system,MMC) 裝備系統,可用于微生物的生長曲線測定、適應性進化、單因素多水平分析及代謝物檢測等,為面向微生物菌種高效選育的進化培養和篩選提供了高通量儀器平臺。


圖片


微生物培養是微生物科學研究和工業應用領域的重要基礎,廣泛應用于微生物的分離、鑒定、分析、篩選、馴化、適應性進化、菌株改造等方面[1-3]。然而,傳統微生物培養方法主要以試管、搖瓶、固體平板為培養容器,輔以搖床、分光光度計、酶標儀等設備進行微生物的培養、檢測和篩選,存在操作繁瑣、效率低、耗時、耗力、耗物等問題。近年發展起來的高通量培養手段主要是以微孔板為容器建立起來的培養篩選體系,但微孔板一方面溶氧水平低,混合效果差、蒸發效應和熱效應比較嚴重,常常導致菌種生長狀況差,且差異性大[1,4-6];另一方面需要配套昂貴的設備,如移液工作站、酶標儀等,才能實現自動化培養和過程檢測。

液滴微流控作為微流控技術的重要分支,是近年來在傳統連續流微流控系統基礎上發展起來的,利用互不相溶的兩液相產生分散的微液滴并對微液滴進行操作的非連續流微流控技術[7]。微液滴具有體積小、比表面積大,獨立無交叉污染等特點,再結合液滴可控性強、通量高等優勢,已經有研究將其用于微生物的高通量培養[8]、馴化[9]、篩選[10-12]等方面,展現出重要的應用潛力。然而,液滴微流控從實驗室技術走向應用推廣仍然存在一系列關鍵問題。首先,液滴微流控操作繁瑣精細,技術要求和門檻高;其次,液滴微流控技術涉及光、機、電的元部件聯合使用,且需要和生物技術應用場景結合,如果沒有多學科交叉協作,一般單個實驗室或團隊難以搭建高效的液滴微流控系統,從而無法開展液滴在微生物技術中的廣泛應用研究;再次,由于液滴體積極小 (皮升微升),面向微生物傳代、進化和分選的等基本操作的自動化液滴精確操控與實時在線檢測實現難度大,難以形成一體化裝備系統[13]。為解決液滴微流控技術在微生物研究中應用推廣的關鍵問題,筆者團隊開展了一系列應用基礎和工程轉化研究工作,成功地開發了一款基于液滴微流控技術的全自動高通量微生物微液滴培養系統 (Microbial microdroplet culture system,MMC)。該系統包含液滴識別模塊、液滴光譜檢測模塊、微流控芯片模塊、進樣模塊等多個功能模塊,通過上述模塊的系統集成和控制,精確地建立了液滴的發生、培養、監測 (細胞光密度 (Optical density,OD和熒光)、分割、融合、分選等系列單元的自動化操作體系,從而成功地實現了微生物液滴培養過程需要的接種、培養、監測、傳代、篩選等功能的集成化。MMC系統中每個液滴體積為2–3 μL,可以容納高達200個液滴培養單元,相當于200個搖瓶培養當量。該微液滴培養體系能保證微生物生長過程中的無染菌性、溶氧、混合和質能交換等需求,通過光譜檢測指標對微液滴內的微生物可進行傳代、多梯度化學因子添加、提取等系列操作,滿足微生物研究的多種需求,比如生長曲線測定、適應性進化、單因素多水平分析、代謝物研究 (熒光檢測法等。


1
技術原理及設計思路


1.1
液滴識別原理及方案設計

在液滴微流控系統中,對每個液滴的快速正確識別是對微液滴進行精準操作的前提。Jakiela等采用機器視覺方法,通過攝像機對芯片進行圖像采集,利用其開發的邊緣識別算法,實現對芯片內微液滴的精確識別[9]。但該方法需要光源照明,會嚴重干擾本研究中的光譜信號檢測,同時所需配套設備較為昂貴復雜,不易實施,因此需要開發一種快速簡易的油水識別系統,并且不對光譜信號采集產生干擾。液滴微流控系統中的水相和油相均為無色透明液體 (水相可能會因為內容物的變化而出現顏色濁度的變化),光吸收度幾乎相同,基于光吸收原理的普通的光電檢測系統則無法進行精確識別??紤]到油水兩相的光反射率和折射率不同,本研究提出并設計了如下的光電檢測系統 (1):激光以一定的角度斜射至芯片通道檢測窗口處,光電探測器置于芯片微通道下方,油相和水相流經該檢測窗口處時,由于兩者的光反射率和折射率不同,造成光的反射和折射具有較大差異,因此進入光電探測器的光強會產生較大變化,轉化輸出的電信號具有明顯特征,進而實現液滴的快速精確識別。


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1  液滴識別系統示意圖

Fig. 1  Schematic diagram of droplet identification device.


1.2
液滴光譜檢測原理及方案設計

微生物培養過程需要連續監測微生物細胞濃度 (OD及底物和代謝產物的變化,以便深入研究其生長和代謝特性。MMC系統中液滴的體積小 (2–3 μL) ,并且全封閉運行,無法取樣檢測,同時對于生長量較大的微生物更無法進行稀釋處理。這就需要一個能夠實時在線、大量程的光學檢測系統,且易于操作并具有經濟性。已報道文獻多采用兩種方法進行OD檢測,一種是將光纖集成于芯片之中,位于通道兩側,當液滴經過時進行檢測[9],這個方法對芯片工藝要求較高,芯片制造成本必然會大大增加。另一種方法則采用圖像采集,然后進行灰度分析以獲取近似的OD數據[14]。但該方法難以對復雜的光譜信號進行分段檢測,同時可檢測范圍有限,影響因素多。為解決上述問題,本研究在微流控芯片的實時在線檢測模塊開發中,設計了一種基于光纖的新型短光程光譜檢測系統 (2):該系統將光纖與芯片分離,置于芯片兩側,光纖與光源和檢測器連接,構成光譜檢測通路,微液滴流經芯片的檢測窗口處時,其光譜信號被檢測器讀取和轉換,轉換信號反饋給上位機進行記錄和分析,并匹配到對應編號的液滴中,然后顯示在控制軟件界面上。這種檢測方式操作簡單、實時在線檢測、穩定性高,并且對芯片制造工藝要求較低,加工成本大幅度降低。


2.webp圖片

2  液滴光譜信號檢測示意圖

Fig. 2  Schematic diagram of droplet spectrum signal device.


1.3
進樣技術原理及方案設計

在傳統微流控操作過程中,通常通過兩種方式將樣品引入至芯片。一種是利用注射泵和注射器,先用注射器抽取樣品,然后安裝至注射泵,通過注射泵推動注射器將樣品導入芯片。這種進樣方式需要對注射器以及注射泵閥頭進行清洗和滅菌,在使用過程中反復拆裝,操作繁瑣,操作難度大,且染菌風險高[14]。另一種則是利用基于氣體介質的壓力泵,先將樣品放置在密閉瓶子  中,通過壓力泵對瓶內壓力的控制,將樣品泵入芯 [9]。這種進樣方式雖然簡單,但極易受系統壓力的波動影響,無法精準定量操作。MMC是面向微生物技術應用開發的自動化進化培養裝備,上述兩種傳統操作方式均不能滿足本研究的需求,因此,如何開發出既能夠簡單精確導入樣品,又能夠便于清洗滅菌的進樣系統成為MMC進樣技術的關鍵所在。為此,本研究創造性地將傳統的兩種進樣方式進行了結合,既利用了注射泵進樣的精確性,又利用了壓力泵進樣的便捷性。本研究設計的MMC進樣系統如圖3所示:該系統由油相、注射泵、進樣瓶組成,其核心是進樣瓶   的設計,進樣瓶頂部有兩個管口,中間管口用于油相的進出,側面管口則用于水相的進出。注射泵通過頂部管口,推動油相進入進樣瓶,因為MMC所用的油相密度低于水相,且油相和水相互不相溶,兩相在進樣瓶中形成穩定的分層狀態,進而油相會驅動等體積的水相從進樣瓶的側面管口流出并進入芯片,達到定量向芯片進樣的目的。該設計可避免水相物質流經注射器、閥等裝置,無需清洗,操作簡便安全。同時該系統的組裝操作可在超凈臺中獨立完成,能夠有效地規避染菌風險,滿足后續微生物培養的需求。


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3  進樣系統設計示意圖

Fig. 3  Schematic diagram of sample injection system.


1.4
液滴操作原理及芯片集成化設計

1.4.1  液滴發生

基于微流控芯片的液滴發生技術常見的有3種,分別為流動聚焦法、十字通道法、T形通道法[13],并且常常通過調節油相和水相的進樣流速來控制生成液滴的大小。但由于芯片加工通常存在批次間誤差以及水相粘度差異等問題,不同芯片往往需要調整油相和水相的流速參數,才能形成穩定的微液滴,這些問題一直是微流控芯片應用于微生物培養的關鍵技術挑戰。如何低成本地設計能夠兼容芯片批次間誤差和樣品粘度差異等實際情況,且可以高精度地對液滴進行操作的芯片系統成為關鍵??紤]到T形通道結構簡單易加工、成本較低,本研究將該結構引入芯片設計中。為了克服芯片批次誤差和樣品粘度差異等問題,本研究一反常規液滴微流控的連續進樣方式,發明了獨特的油相和水相間歇順次驅動進樣方法,進而在芯片中生成體積大小精確可控的微液滴 (4A),并通過巧妙串聯使用T形結構通道,可以生成濃度梯度不同且精確可控的微液滴 (4B)。


1.4.2  液滴培養

微生物培養過程通常需要提供合適的溫度、氧氣等條件?;谖⒘骺氐暮醚跷⑸锱囵B,常常用透氣性良好的PDMS作為芯片材質,輔以環境溫度控制,來滿足微生物的生長需求[15]。但是PDMS具有柔性較大、易形變等特點,給液滴的精確穩定操作帶來了極大的負面影響,所以不適合用于本研究。因此,如何既能夠實現液滴培養的氣體交換,又具備良好剛性和光學性能的芯片系統成為微生物微液滴培養的關鍵。而從目前已開發的芯片材質分析,透氣性和剛性往往不可兼得。為此,本研究提出了將液滴操作和液滴培養兩個過程分離的思路,即利用剛性強、光學性能優的材料加工微流控芯片,利用透氣性強、變形性小的微管路作為液滴培養的容器,實現硬質芯片與透氣培養管路的有機結合,成功解決了微生物微液滴培養的難題。液滴在系統運行過程中,不斷往復于培養管路之中,進而充分滿足培養過程中氣體交換的需求。


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4  液滴操作系統:(A:液滴發生;B:多濃度梯度液滴發生;C:液滴分割融合;D:液滴分選)

Fig. 4  Droplet operation system. (A) Droplet generation. (B) Droplet of multi-level concentration gradient generation. (C) Droplet spitting and fusion. (D) Droplet sorting.


1.4.3  液滴分割融合

微生物的傳代培養操作中,需要將培養到一定階段的菌懸液取出一部分,接種到新培養基中,繼續進行傳代培養。在本研究需要實現將已培養的微生物微液滴向新培養基液滴中接種菌液,實現基于微液滴的微生物傳代培養操作。傳統的液滴分割融合方式常常利用芯片結構對已培養的所有母液滴進行分割,生成兩個子液滴,其中一個子液滴則直接從廢液口排出,待所有液滴完成分割后,再將所有待利用的子液滴與新培養基液滴進行融合,從而完成液滴的微生物傳代[9]。但在對已培養的母液滴進行分割處理中,往往存在液滴的識別和驅動過程誤差,造成液滴切割融合的精確性下降,而長期多次操作會進一步導致單次操作誤差的累積,造成最終的液滴體積差異過大,穩定性差等問題。另外,如果分割后的子液滴體積較小,則其在往復運動過程中容易發生相互融合,影響系統穩定性。如何能夠精確實現液滴分割融合操作、避免誤差累積、降低液滴之間融合風險、提高系統運行穩定性成為液滴傳代操作的關鍵。為解決液滴分割融合誤差的問題,本研究創造性地提出掐頭去尾式的液滴分割融合新方法 (4C),即液滴經過識別點時,液滴體積的大部分停留在注入通道中,通過推動主通道中油相流動,對駐留液滴暴露在主通道中的小部分頭部體積部分進行切割,將液滴分割成兩部分,頭部液滴部分被推入廢液通道,另一部分則停留在駐留通道中;此時,將新培養基液滴推動至液滴注入通道口處,然后將被切割液滴定量進入新液滴,再次推動融合后的液滴離開注入通道口,而殘余的液滴尾部則也被推入至廢液中。同時,這種巧妙的液滴操作方式,使得液滴的分割和融合過程緊密相連,避免了小體積液滴長時間運行而可能造成的相互融合,極大提高了微液滴系統運行的穩定性。


1.4.4  液滴分選

液滴從生成開始,通過液滴識別系統對每個液滴進行編號,每個液滴的所有檢測數據都會與對應編號的液滴進行匹配,因此在分選操作實施前,液滴經過識別點進行編號識別,根據培養過程微液滴OD檢測數據,如果是所需液滴,就會通過閥口,收集至收集管中,如果是廢棄液滴則被推入下游管路,繼續下一個液滴的分選處理 (4D),進而實現目標微生物微液滴的分選。


1.4.5  芯片集成化設計

在實現微液滴發生、培養、分割融合、監測、分選的基礎之上,本研究對這些功能結構進行了系統集成,形成了功能完備的集成化微流控芯片系統 (圖5)。其中2號、4號、6號與進樣瓶相連,分別用以盛放種子液、新鮮培養基、化學因子母液。1號、3號、5號均是油相通道,直接與注射泵相連。1號、3號管路為長度為2 m的透氣性良好的AF-2400材質管路 (內徑=1 mm,外徑=1.6 mm)[16],液滴在兩者之間進行往復運動。廢液管與閥相連,用以排出廢液。芯片中的液滴識別點、光譜檢測點則分別作為液滴識別窗口和光譜檢測窗口。芯片系統整體置于恒溫控制倉中,保證微生物培養提供所需的最適溫度。


1.5
系統結構集成及其自動化方案設計

在上述各模塊功能基礎上,通過光機電一體化結構設計,對各功能模塊進行集成和控制系統開發,實現了微生物微液滴的自動發生、往復培養、在線監測、分割、融合、分選等功能的有序操作,整機結構設計如圖6所示:鹵素燈和光譜儀作為光學檢測的功能元件,通過光纖連接至芯片檢測窗口處,對運行中的液滴進行光譜數據采集和分析;閥和注射泵組協調聯動,構成整機動力模塊;芯片系統和進樣瓶均分布在操作倉中,并通過加熱片對其進行恒溫控制;油相瓶和廢液瓶分別盛放油相試劑和廢液。

多部件的協調控制是實現裝備自動化運行的關鍵,本研究研制了用于MMC自動化操作的軟件控制系統 (7)。通過在金屬浴模塊、操作倉溫控模塊、液滴識別模塊中分別設置溫度傳感器1、溫度傳感器2、光電傳感器,可以將這些傳感器所采集數據通過底層通訊協議傳輸給基于行調ARM單片機開發的下位機控制系統。下位機系統將所收集的數據與上位機系統發送的數據進行對比,然后對金屬浴模塊中的加熱1、操作倉溫控模塊的加熱器2、液滴識別系統中的激光器進控。泵閥組與光譜儀作為第三方元部件,其本身擁有自身的驅動控制板,通過通訊協議,可直接接受上位機軟件的控制進行精確工作。


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5  集成化微流控芯片系統結構示意圖

Fig. 5  Structure diagram of integrated microfluidic chip system.


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6  集成化設備結構示意圖

Fig. 6  Schematic diagram of integrated equipment structure.


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7  MMC自動化運行控制系統框架圖

Fig. 7  MMC automatic control system frame.


1.6
MMC用于微生物培養測試

MMC系統可以將液滴的發生、培養、監測、分割、融合、分選等復雜過程進行自由組合,形成不同運行邏輯,進而適于多種多樣的微生物應用研究。本研究基于MMC設備進行了微生物的生長曲線測定、單因素多水平實驗、適應性進化實驗、代謝研究等多種應用展示。


2
材料與試劑
2.1
裝備主要元部件、芯片系統原料、主要實驗設備

MMC所用的注射泵購于帝肯 (CavroXcalibur Pump);電磁閥 (Mrv-01) 購于潤澤流體;鹵素光源 (HL2000) 和光譜儀 (EQ2000) 購于上海辰昶儀器設備有限公司;激光器購于華上激光科技有限公司;亞克力板和微管路 (AF-2400材質均購于上海尚久橡塑制品廠;SMA905光纖購于深圳鑫瑞光技術有限公司;紫外-可見光分光光度計 (721G型號購于上海儀電分析儀器有限公司;臺式恒溫搖床 (THZ-D) 購于蘇州碩舟科技有限公司。


2.2
MMC測試所用菌種、試劑及基本培養和分析方法

實驗中所用菌種為大腸桿菌Escherichia coli MG1655,含綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein,GFP表達質粒;所用培養基為LB培養基 (成分:蛋白胨0.5 g,酵母提取物0.25 g,氯化鈉0.5 g,加水50 mL);礦物油 (含表面活性劑span 80,濃度為10 g/L) 購自Sigma-Aldrich;單硫酸卡那霉素 (獸用購自山東魯西獸藥。

大腸桿菌種子液制備:從平板上挑取大腸桿菌E. coli MG1655菌落接種至LB培養基中,在37 ℃、220 r/min搖床條件下活化培養3–4 h。

大腸桿菌在MMC中培養過程:取大腸桿菌種子液,按照5%的接種量接種至含5 mL培養基的15 mL離心管中混勻,然后轉移至MMC進樣瓶中進行上機實驗,MMC中培養溫度設定為37 ℃,根據不同的需求和條件,設定MMC的軟件系統進行培養。

大腸桿菌分光光度計檢測方法:取大腸桿菌懸液稀釋至OD6000.2–0.8之間,使用分光光度計測定OD600值,并根據稀釋倍數計算原始樣品OD600值。


3
結果與分析


3.1
液滴識別系統研制及測試

將波長為620 nm的半導體激光器照射在液滴識別窗口處,入射角從逐漸增大至接近90°,觀察液滴和油相經過檢測窗口處時光電壓值大小 (8A)。通過實驗發現,當入射角為36°時,液滴經過檢測窗口的光電壓信號值可以穩定大于3 V,而此時油相的光電壓信號值則穩定小于0.6 V (8B),據此可以將油相和液滴進行精確的區分,每個液滴的識別時間小于0.3 s,從而實現了液滴的快速精確識別。且該系統結構簡單、運行穩定、易批量化搭建。


3.2
液滴檢光譜檢測系統研制及測試

芯片檢測窗口處通道深度為1 mm,所以對應的光吸收度檢測光程約為1 mm,這區別于常規標準比色皿所使用的1 cm光程,由于測量光程的大幅度減小,OD的線性范圍和可檢測量程得到了大幅度提高。通過對大腸桿菌的離心處理,獲得高濃度的菌懸液,將該懸液進行梯度稀釋,并同時用傳統的紫外-可見光分光光度計和MMCOD直接檢測系統 (無稀釋進行比較測試 (9)。通過實驗發現,MMCOD直接檢測量程達到30,檢測靈敏度為0.05,此外,MMC直接測得的OD值與基于稀釋法的分光光度計檢測OD值在0–20之間成良好的線性關系。并且與傳統的OD檢測方式的頻繁取樣和稀釋操作相比,MMC具有無需取樣、無需稀釋、實時在線檢測等多種顯著優勢,有利于實現MMC的自動化操作。


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8  液滴識別系統 (A:裝置實物圖;B:液滴和油相的電壓信號值)

Fig. 8  Droplet identification system on chip. (A) Image of chip for detection. (B) Detected signal of droplet and oil.


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9  液滴光譜檢測 (A:液滴光譜信號檢測裝置圖;BMMC和分光光度計的中OD600檢測數據對比)

Fig. 9  Droplet spectral detection. (A) Photo of droplet OD measurement set. (B) Calibration curves for OD measured by UV-VIS-spectrometer and MMC detection.


3.3
進樣瓶研制及測試

進樣瓶是向芯片穩定精確進樣、無菌控制的關鍵。由于進樣瓶的原理是等體積的油驅動等體積的水相樣品進入芯片,因此進樣瓶內不允許有氣泡存在,否則由于氣泡的可壓縮性過大,會嚴重影響進樣的精確性。為了保證進樣瓶裝樣時空氣的完全排除,無氣泡殘留,本研究將瓶帽設計于瓶子底部,而進樣瓶內頂部則采用圓弧形設計,便于瓶內氣泡的充分排出 (10)。在操作過程中,我們首先在超凈臺內將樣品加入到瓶子中,并補充油相至瓶子完全充滿,由于密度不同,在瓶子中油相位于上層而水相位于下層,裝完樣品后,將進樣瓶中間的油相出入口接口插入側邊的水相出入口中,形成密封,防止轉移過程中造成樣品污染,從超凈臺拿出后,將其與芯片和儀器進行連接,水相出口 (Sample outlet) 與芯片連接,油相入口 (Oil inlet) MMC儀器接口連接,通過注射泵推動油相即可實現定量驅動水相進入芯片。這種方式不僅避免了樣品染菌風險,同時操作簡便、極易清洗滅菌,大大提高了儀器的操作簡便性。


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10  進入芯片形成液滴的進樣瓶實物照片

Fig. 10  Photo of sample bottle flowing into chip to make droplets.


3.4
微流控液滴操作芯片研制

經過多次實驗測試,本研究最終選用聚甲基丙烯酸甲酯 (Polymeric methyl methacrylate, PMMA) 材質進行芯片加工,該材質具有光學性能好、易加工鍵合、剛性較好等特點。標準芯片通道深度和寬度均為1 mm (11A) 。與芯片連接的管路采用AF-2400材質,該管路透氣性好,可以滿足多數微生物的氣體交換 (11B) 。液滴的生成、切割融合、分選、檢測均在芯片中進行,而液滴的培養則是在管路中進行。油相和水相樣品一端通過管路與芯片連通,另一端則與注射泵連通。芯片上分布有液滴操作的相關流道以及用于液滴識別和檢測的窗口。


3.5
系統集成結構及工業化MMC裝備研制

通過對MMC系統各個功能模塊的光機電結構一體化設計及集成,最終形成了商業化應用設備 (12A)。MMC系統操作倉室內部采用恒溫控制,芯片和樣品均放置在操作倉中。油相試劑放置在油相試劑倉室,運行過程中產生的廢液則排放至放置在廢液瓶倉室的廢液瓶中。MMC儀器下側的注射泵倉室中放置儀器所使用的6臺工業注射泵。在恒溫操作倉室內部 (12B),紫外燈為倉室進行照射滅菌處理,進樣瓶放置于金屬浴中,可以快速升溫并保持穩定,避免瓶子熱脹冷縮對進樣精度造成的影響,為方便液滴收集,設計EP管支架于倉室內。


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11  芯片系統實物圖 (AMMC微流控芯片實物圖;BMMC培養管路實物圖)

Fig. 11  Photo of microfluidic chip system. (A) MMC microfluidic chip. (B) MMC culture tube.


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12  MMC實物圖 (AMMC外觀;B:恒溫倉室內部結構圖)

Fig. 12  Photo of MMC. (A) The exterior of MMC. (B) Internal image of temperature control space in MMC.


3.6
MMC用于微生物培養的測試

在本項目所研制的MMC裝備上,本研究分別進行了大腸桿菌的生長曲線測定、適應性進化實驗、單因素多水平實驗以及微生物代謝水平檢測實驗。在這些實驗中,均采用培養至對數期的大腸桿菌作為種子液,以5%接種量接種至進樣瓶中,設置OD檢測波長為600 nm。各實驗根據不同需求設置不同的液滴生成數量,每輪實驗開始前,均需要對設備及芯片進行初始化運行,然后開始進入正式實驗,各實驗結果如下。


3.6.1  生長曲線測定

生長曲線測定實驗是研究微生物生長狀況的基本實驗。在設備初始化完成后,選取軟件中生長曲線測定功能,設置液滴數量為20,點擊運行,28 h后導出液滴培養數據并進行處理。本研究對20個液滴的生長數據進行平均值和標準差分析,繪制出大腸桿菌的生長曲線,結果如圖13A 所示:生長曲線程“S”形,且20個液滴生長一致性良好,各液滴之間的OD值變異系數小于5%,充分說明了該設備良好的微生物培養和檢測性能。


3.6.2 適應性進化研究

在在微生物的適應性進化研究中,常常需要在對微生物進行持續傳代的過程中,逐漸提高耐受因子的濃度。本實驗中,以氯化鈉作為耐受因子,選取MMC操作軟件中適應性進化模塊,設置液滴數目為30,每傳代3次,將氯化鈉 (NaCl) 濃度提高到一個新的水平,持續傳代馴化,獲得的進化培養結果如圖13B所示:圖中具有周期性的峰形曲線代表微生物的每一代生長曲線,而峰谷則代表在該時間點處進行了微生物的傳代操作,OD值會驟然下降,紅色折線則代表對應培養時間下液滴培養單元中的鹽濃度,其梯度濃度由小到大依次為11 g/L、11.5 g/L、12 g/L、12.5 g/L,每個濃度梯度下進行3次大腸桿菌的連續傳代培養 (20 h),然后提升到更高的濃度梯度繼續傳代馴化。該馴化過程共進行80 h,隨著鹽濃度的逐漸提升,大腸桿菌的生長速率和OD最大值逐漸下降,但每批傳代液滴里的微生物均能生長,并且隨著進化進行,液滴間OD逐漸呈現出差異變化。該實驗過程充分體現了適應性進化的基本實驗策略,即在長期的傳代培養過程中,通過逐漸提高耐受性因子水平,以進化出菌種的耐受性。由于MMC的液滴培養單元僅為2 μL,試劑消耗量極少,而進樣瓶可以一次性盛放12 mL的樣品,因此單次上機操作能夠滿足多達150次的連續傳代培養。同時,如圖13B所示,MMC中的每個液滴代表獨立進化培養單元,MMC的在線檢測功能可以為微生物進化培養過程提供海量數據,因此結合MMC的底物和代謝產物檢測功能及后續多組學分析方法,能夠對微生物進化過程進行系統深入的分析。


3.6.3  單因素多水平實驗

單因素多水平實驗是在常規微生物實驗中,用以測定某個化學因子對微生物生長狀態的影響。本實驗中以單硫酸卡那霉素作為化學因子,研究其對大腸桿菌生長的影響。樣品上機后,選  取軟件中單因素多水平功能,設置參數為:梯  度個數8,每個梯度平行單元 (液滴10個,啟動設備運行功能即可。結果如圖13C所示:圖中不同顏色曲線代表不同的單硫酸卡納霉素培養條件下大腸桿菌生長情況,每條曲線都是根據在單個梯度下,對10個平行微液滴單元的OD檢測值進行統計處理得到的結果。從圖中可以看出,隨著單硫酸卡納霉素的濃度增加,大腸桿菌的生長受抑制情況越來越嚴重。相對于傳統在線檢測設備,MMCOD檢測線性范圍寬 (0–20),可以將微生物生長過程完整地記錄下來,能夠更加便捷地研究化學因子對菌種生長的影響規律。


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13  MMC在大腸桿菌培養中的應用 (A:生長曲線測定;B:以氯化鈉為進化壓力的菌株適應性進化;C單硫酸卡那霉素對大腸桿菌生長的單因素多水平影響實驗;DMMC中菌株代謝檢測 (GFP熒光檢測))

Fig. 13  Use of MMC in E. coli culture. (A) Growth curve test. (B) Adaptive laboratory evolution experiment using NaCl as the selective pressure. (C) Single-factor experiment for bacterial growth with addition of kanamycin monosulfate at different concentrations. (D) Online monitoring of bacterial metabolism in terms of GFP fluorescence during the cell growth in MMC.


3.6.4  微生物代謝水平研究

微生物代謝水平??梢酝ㄟ^熒光信號來檢測表征,本研究利用的大腸桿菌含有GFP基因,其熒光信號強度變化可反映微生物的代謝狀態變化。選取MMC軟件中熒光檢測功能模塊,設置熒光激發與檢測波段為 (485ex/528em,即激發波長485 nm,發射波長528 nm),液滴數目為10,結果如圖13D所示。圖中的黑色曲線代表大腸桿菌OD值變化,綠色曲線是GFP熒光值變化。從圖13D可以看出,隨著大腸桿菌的生長,其GFP熒光信號強度也在逐漸增加,表明GFP的合成與細胞生長偶聯,而培養到達平臺期后,GFP熒光強度基本保持不變,表明蛋白合成結束。MMC這種在線快速檢測熒光的方式,結合微生物生長曲線的在線檢測和進化培養及分選功能等,對于能夠合成自身具有熒光的代謝產物的微生物及以熒光蛋白作為分子標記的基因工程菌的代謝特性研究具有平臺支撐作用。

除了上述4種典型的微生物實驗和微生物篩選外,MMC還可以根據使用者的自身需求,支持自定義編程多種功能,設置不同的液滴操作流程,以滿足各種實驗需要[17]。同時,已有的研究結果也表明,MMC可應用于多種微生物的培養研究,表現出明顯優于孔板的應用成效,具有廣譜適用性[18]。


4
討論


液滴微流控技術因生成的液滴體積小、通量高、質能交換快、可獨立操作等特性為微生物研究提供了新方法,但其操作要求高、影響因素多、缺乏自動化集成等問題限制了該技術的應用推廣。本研究針對上述關鍵難題,通過設計開發液滴識別功能模塊、液滴檢測模塊、進樣模塊以及芯片模塊等,將液滴的發生、培養、檢測、分割、融合、分選等多種復雜操作進行有機集成,成功研制出了一款全自動高通量微生物微液滴培養系統 (MMC),形成了小型化、自動化、高通量的微生物培養系統,并且操作簡單,運行穩定。相比于傳統的微生物高通量培養裝備,MMC具有物料消耗少、操作簡單、在線檢測 (OD和熒光)、數據采集密度大、普適性強等多種優勢。

目前,本研究已經完成了MMC系統底層單元操作的開發,未來需要針對微生物研究的不同需求,進一步豐富MMC系統應用功能,例如開發多因素多水平正交實驗功能,多樣品自動進樣技術用以同時測定多個菌種的生長曲線,液滴內氧分壓和pH等參數的精確控制等,全面助推微生物培養進入高通量智能化的微滴時代。


通訊作者1

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邢新會
清華大學教授、博士生導師、百人計劃入選者。


主持國家自然科學基金重大儀器專項項目、中以國際合作項目。發表學術論文280余篇,合作著書8本,編寫英文專著1部,譯著教材2部。申請發明專利100余項,獲得發明專利80余項。擔任Biochemical Engineering Journal副主編及《生物工程學報》等多個國內外學術期刊編委。獲得第17屆全國發明展覽會獎銀獎 (2007)、北京市科學技術獎三等獎 (2008)、中國石油和化學工業協會技術發明獎二等獎 (2009)、中國僑界貢獻獎 (創新人才) (2010)、高等學??茖W研究優秀成果獎 (科學技術科技進步獎 二等獎 (2015)、  45屆日內瓦國際發明展金獎 (2017)、中國化工學會系統2012–2017度先進個人 (2017)、全國歸僑僑眷先進個人 (2018)、日本東京大學工學院會士 (Fellow) 榮譽稱號 (2018) 中國輕工業聯合會技術發明一等獎 (2019)。


通訊作者2

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張翀
清華大學化工系副教授,教育部青年長江學者。


主持國家自然科學基金項目、國家重點研發計劃課題。在Nature Chemical Biology、Nucleic Acids Research、Metabolic Engineering等學術期刊發表多篇論文。擔任中國生物發酵產業協會微生物育種分會秘書長、Carbon Resources、Food Science and Human Wellness等期刊編委。獲得中國輕工業聯合會技術發明一等獎 (2019)、長江學者獎勵計劃青年學者 (2018)、“倫世儀教育基金”杰出青年學者獎 (2018)、第45屆日內瓦國際發明展金獎 (2017)。


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